高起始量带分子标签的DNA-Seq分析

更新时间：2020-11-10 点击次数：1442

高起始量带分子标签的DNA-Seq分析

ThruPLEX^® Tag-Seq HV

· 更可靠的DNA-Seq分析：文库中整合了离散且均衡的分子标签（UMIs），提供更可靠的数据表现！
· 兼容更高起始量的多种样本：5至200 ng FFPE DNA、cfDNA起始，30 μl建库体积，无需浓缩样本！
· 删繁就简：单管三步操作流程，2 h内完成illumina文库构建！
· 一致高效：无畏起始量差异，高实验重复性、更均一的文库覆盖度，高GC含量区域偏差更小！
· 更适合于稀有突变分析，减少扩增误差及测序错误！

■ 产品说明

目前，将NGS用于正确检测低频突变的关注度逐渐上升。各领域科研人员正在突破稀有突变检测灵敏度与特异性的瓶颈，而这些问题主要是由样品准备、扩增偏差及测序错误所引起的。而向illumina文库添加*的分子标签（Unique Molecular Identifiers, UMIs）与*的双端index(Unique Dual Indexes, UDIs)，能有效改善稀有突变检测的准确性。出于文库制备与测序质量直接相关的考虑，我们特别优化推出了接头上带UMIs及整合UDIs的全新产品——ThruPLEX Tag-Seq HV试剂盒。该产品保留了单管流程、操作简便的特点，支持5至200 ng input DNA起始用于稀有变异分析！

正确的样本数据回溯、更小的手动操作误差，科研人员再不用担心珍贵样本损失了！

■ 来自UMIs的“助攻”

ThruPLEX Tag-Seq HV在茎环形接头上引入了离散的UMIs，文库中每个DNA分子有144种可能的标签组合，汉明间距超过6，具有高度的差异性。我们特别设计了UMI序列，以使序列颜色分布达到平衡，在illumina平台上能获得更好的测序数据。我们也谨慎调整了各UMI接头的浓度，以使144种序列组合在各种DNA起始量都能均匀展现，减少偏差。

由7位碱基所组成的UMIs位于reads的开始位置，能够”Tag”到DNA模板上，用于识别一致序列，减少扩增或者测序错误带来的假阳性突变。

这种特别优化的UMIs设计，确保了更简便的样本demultiplexing过程，分析更容易！

■ “抓住”游离DNA，“揪出”稀有突变

游离DNA（cfDNA）是由细胞凋亡后所释放，游离于体液中的DNA小片段。对cfDNA的测序分析具有较大难度，特别是涉及肿瘤学研究中的稀有突变分析时。
Takara科学家采用ThruPLEX Tag-Seq HV对10 ng起始的Quan-Plex Patient-Like ctDNA标准品（AccuRef）构建文库，该ctDNA(循环肿瘤DNA)标准品带有一系列特征化的不同频率（0%，1%，5%）突变位点。文库构建完成后，肿瘤相关的基因采用IDT xGEN Pan Cancer Panel进行捕获富集。结果显示目标区域的捕获高效可靠，10 ng起始的DNA样本约有79%的reads来自或者接近目标区域。

上表数据显示，由坐标法或UMIs去除重复reads后的目标区域平均覆盖度是相似的，与Picard MarkedDuplicates所报道的PCR duplication结果一致。
随后，Takara科学家用UMIs鉴定了ctDNA标准品中特定位点的实际突变频率，结果显示，检测到的突变频率分别与预期1%、5%的等位突变频率接近，而阴性对照组没有在位点处检测到任何突变。

如果采用未去重的文件或仅用坐标法去重的文件，会检测出大量的超过0.5%等位基因频率的不一致突变。而UMIs引入、校正后，相应突变体的数量变少了，结果的正确性进一步提升，显示出UMIs在降低扩增及测序错误上的重要作用。

更具代表性的是，使用未去重或者仅用坐标法去重的文件分析，在预期的EGFR L858R突变附近观察到大量的低频及随机等位基因频率突变。而用UMI校正、过滤后的一致性序列reads，清除了假阳性突变，得到了预期的突变分析结果！

订购信息：

品牌 Code No. 产品名称包装量

Clontech R400742 ThruPLEX^® Tag-Seq HV 24 Rxns

Clontech R400743 ThruPLEX^® Tag-Seq HV 96 Rxns

Clontech R400735 ThruPLEX^® Tag-Seq HV Core Components 96Rxns

Clontech R400734 ThruPLEX^® Tag-Seq HV Core Components 24Rxns

Clontech R400739 ThruPLEX^® HV UDI 1-24 24 Rxns

Clontech R400738 ThruPLEX^® HV UDI Set A 96 Rxns

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