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细胞培养中检测支原体的常用方法

更新时间:2021-04-06 点击次数:2283

支原体是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具有细胞壁的原核微生物,能在无生命的人工培养基上生长繁殖,直径50-300nm,能通过细菌滤器。支原体在过去曾称之为类胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia-like organism,PPLO),1967年正式命名为支原体。

 

支原体(mycoplasma):又称霉形体,为目前发现的原核生物,基因数量为480。支原体细胞中可见的细胞器是核糖体(支原体是原核细胞,原核细胞的细胞器只有核糖体)。支原体结构也比较简单,多数呈球形,没有细胞壁,只有三层结构的细胞膜,故具有较大的可变性。

 

支原体这种微小的微生物,是细胞培养中令人头疼的大问题。支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者,会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。支原体感染不易察觉,因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。

污染实验室培养细胞的支原体主要有八种,但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。支原体非常顽强,通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。例如青霉素主要作用于细菌细胞壁,但支原体没有细胞壁因此就不受影响。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的方式,另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要,这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。下面就为大家介绍几种在培养细胞中检测支原体的方法。

 

分离培养法

 

分离培养法是支原体检测的金标方法,其检测度高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体,它们就会在这种琼脂平板上*生长,形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类,分离培养法也有力所不及的时候,例如支原体M. hyorhinis。

 

DNA检测法

 

DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养,因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞,如果原样本中含有支原体,那么当细胞DNA被荧光染料(如Hoechst染料)染色时,就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以准确的将其检测出来。

   

 

PCR  

 

PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株,PCR法检测支原体只需几个小时,是但也是的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本,其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体,但谨慎起见同时使用另一种检测方法来进行验证。

 

酶学检测和ELISA

 

此外,也还存在一些其他支原体检测方法。例如酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中,在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP,随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测,以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,来检测培养物中是否含有支原体。

 

 

定期检测法

 

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

 

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