解析细胞冻存液和培养基的配制
1、准备工作
（1）细胞培养基： 1L； ：L-15:500ml； 配置量： 配方 DMEM:350ml； Ham’s F12:150ml；NaHCO3：1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mgEGF:50μg灭活 FBS:50ml；双抗：10ml
（2）冷冻保护液：配制量：40ml；配方：FBS:8ml；DMSO:3ml；培养基：29ml
2、细胞培养基配制方法 FBS*天准备工作： 两支， 提前一晚四度冰箱解冻； 烘干硅胶（用于第二天干燥盒干燥 insulin）
（1）细胞培养基配制准备工作：1L 广口瓶三个，提前高温高压灭菌（用于盛放培养基） ；1L 烧杯一个，三个，；50ml 离心管 22 支 ；
（2）取一包 Ham’s F12 干粉加入到 800LddH2O 中将溶液反复冲洗包装内面两次，倒入培养液中，使干粉充分溶解； 将培养基转移到 1L 两桶中， 取少量 ddH2O 润洗烧杯， 定容至 1000ml。同样方法配制 L15 培养基和 DMEM 培养基。
（3）取 L-15:500ml；DMEM:350ml；Ham’s F12:150ml 加入到大烧杯中，配制成混合培养基。
（4） 取 NaHCO3： 称 1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mg全部溶于混合培养基， Insulin 放置于-20℃ 。冰箱中，置于室温的时候冰晶解冻为水滴，影响胰岛素称量精度，故需要放置到干燥盒中干燥 30min-60min； 称量装置为精细天平， 打开精细天平后， 打开仓门， 放置一张干净称量纸，按 TARE 键清零。用擦净的药匙取极少量干粉，观察示数，加至 0.0100g。小心取出称量纸，将干粉加入到培养基中， 用食指轻轻弹称量纸使剩余粉末进入培养基， zui后用少量培养基溶液冲洗称量纸，保证所有 insulin 进入培养基。
（5）利用 NaOH 溶液调 PH 值至 7.5：用之前调好 PH 测量器，分别在 7.0、10.0、4.0 处调试PH，确定后测定 PH。
（6）加入双抗溶液 10ml。
（7）在超净台上利用 0.2μm 滤膜过滤除菌（这步骤工作量较大，需要两个同学完成） 。大概过滤 200ml 后滤膜会堵住，需要重新更换。
（8）FBS 灭活：提前约 15min 将水浴锅打开，温度设置在 54℃（本实验室水浴锅温度通常高于实际温度 2℃，实际温度以温度计为准） 。用样品袋包装盛放 FBS 的 50ml 离心管，挤出空气，放置在 56 摄氏度下灭活 30min。
（9）FBS 分装：分装到两个 15ml 离心管和 20 个 EP 管中，放置于-20℃冰箱中
（10）分装：分装到 50ml 离心管中，4℃保存。细胞培养基使用前加入 2.5mlFBS，250μlEGF溶液（EGF 溶液浓度为 10ng/μl）。
3、细胞冻存液配制：将 FBS:8ml；DMSO:3ml；培养基：29ml 加入到 50ml 离心管中，混匀。
使用细胞冻存液冻存细胞操作方法
（1）冻存前一天，更换培养基。
（2）吸出培养瓶中的培养基，用 0.05胰酶-EDTA 消化细胞（根据培养面积加入相应胰酶试剂），5min，吹散细胞。
（3）加入与胰酶-EDTA 等量的培养基，终止消化；然后 1000rpm，离心 5min。
（4）去除上清，加入适量培养基（在 EP 管架上滑动，使细胞分散，之后用枪头轻柔吹打，使细胞*均匀悬浮） ；进行细胞计数：细胞计数，取细胞计数器，每孔加 10μl 细胞悬液，在计数区（中央 25 个格子） ，用细胞计数器计数，移动计算下方计数区细胞数量。细胞总量计算公式，AB/2稀释倍数106。AB 为上下两个计数区细胞总数。
（5）1000rpm 离心 5min。
（6）加入适量冻存液（在 EP 管架上滑动，使细胞分散，之后用枪头轻柔吹打，使细胞*均匀悬浮），使细胞zui终浓度达到 1-3106cell/ml。
（7）将细胞悬液加入到冻存管中，每管 1ml：冻存管提前用标签笔写入如下信息，细胞名称，传代次数，细胞数量，冻存日期。
（8）取出冻存盆，在通风橱中向槽内加入适量异丙醇（因为异丙醇具有微毒性）。将冻存管插入到冻存盆的凹槽中，放于-80℃冰箱中过夜。
（9）第二天早上将冻存管转至液氮中：用棉纱布包裹冻存管，用粗棉绳扎紧，打上标签，写上冻存日期，细胞种类，传代次数，细胞数量。
