脐带血干细胞改良HES分离法是将传统的HES分离法进行优化和改进,在后期给予氯化铵将红细胞液的体积缩减与分离。详细的操作步骤如下:
1.确保操作时在无菌的环境下进行,因而需要准备超净台对穿刺部位进行消毒;
2.然后将6%的HES分别按照脐血血量的1/4加入到采集来的血袋中;
3.混合均匀后使用无菌封口胶密封穿刺点,倒置与10℃的低温环境中静置6小时;
4.分离好后先将脐血下层的红细胞缓慢的放出,取50ml离心管置于其中,然后将血浆放入另一只50ml离心管中;
5.把盛有红细胞的离心管,室温、600r/min、离心5分钟,把上层的血浆部分吸出后置于另一只盛有血浆的50ml离心管中,将剩下的红细胞丢弃即可;
6.把收集血浆的离心管,室温、600r/min、离心5分钟,取上清部分保留在50ml离心管中,将下层红细胞去除;
7.将上步中收集的上清液室温、1200r/min、离心10分钟,去1ml上层血清作为备用,将其他上清去除,将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml,用PBS 将体积调整至25ml;
8.重复上步操作3次,将zui终得到的细胞用PBS调整体积支5ml;
9.将得到的有核细胞液与氯化铵破红细胞液(NH4CL)按照1:1的比例进行混合,室温、800r/min、离心10分钟,弃上清所有的下层细胞用PBS反复清洗3次,重悬细胞于上述步骤7作为备用上清液,然后将体积调整至1000μl;
10.用微量移液器吸取包细胞稀释液0.49ml转移至EP管内,加入10μl细胞悬液混匀后,在低倍镜下计算池四角的四个大方格的有核细胞数,将其总数×125 , 即得到1μl 悬液内的有核细胞数;
11.用微量移液器去0.49mlPBS液移至EP管中,加入有核细胞悬液10μl混合均匀后加入0.5的台盼蓝染液100μl再将其混合均匀后等待2分钟,制片镜检计数;
12.取NC混悬液50ul用流式细胞仪检测人源性CD34 +细胞的含量,具体的方法如下:
(1)在上机试管底部加入50μl 样品;
(2)加入单克隆抗体CD34-PE10ul混匀;
(3)避光室温孵育20分钟,加入500μl 红细胞裂解液充分混匀;
(4)室温静置20分钟后加入PBS也500μl充分混匀;
(5)上机检测。
13.去10ul的有核细胞悬液进行需氧菌、厌氧菌和霉菌培养,需氧性与厌氧性杂菌培养均采用硫乙醇酸盐培养基,霉菌与腐生菌培养均采用改良马丁培养基,然后将其分别置于30-35摄氏度和20-25℃的培养箱中培养14天,后观察结果即可。