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常用的融合蛋白分为哪几类的呢

更新时间:2015-06-05 点击次数:4944
常用的融合蛋白从分子量和用途上来分,一般可分为如下三类: 

1. 小分子量的融合肽:这类标签蛋白只有几个氨基酸,如poly His,StrepII-tag,FLAG,c-myc-等,主要用于靶蛋白的纯化,也可用于靶蛋白的辅助检测,且由于分子量很小,几乎不干涉靶蛋白的结构,活性和功能,一般纯化后不用去除标签,非常简单方便。目前zui常使用的是poly His标签蛋白,可使用金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化,用梯度浓度咪唑溶液洗脱。当靶蛋白为包涵体时,也可在变性条件下纯化靶蛋白,容易实现规模化,是目前应用的方法。但是该方法也有自身的局限性,由于许多蛋白有内在的组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基,其它的非特异蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析柱料发生结合,影响靶蛋白的纯度;另外,咪唑可能会影响晶体学,NMR等实验;咪唑也会导致一些蛋白质的聚集;由于金属离子可吸附到NTA树脂上,带金属离子中心的蛋白质也不适合用该方法纯化,另外Ni2+-NTA可被还原,在厌氧条件下也不适合使用该方法。
Strep-tagII,只有8个氨基酸(色氨酸-丝氨酸-组氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸)的小标签,该标签与固定在以Sepharose为基础的基质上的Strep-Tactin 配基特异性结合,并且Strep-tagII与Strep-Tactin的结合亲和力比链霉抗生物素蛋白结合亲和力多大约100倍,使得StrepTactin Sepharose 高性能适合纯化Strep-tag II蛋白,得到的靶蛋白纯度更高。纯化均在生理条件下进行,使用脱硫生物素温和的洗脱很好地保护了靶蛋白的活性。Strep-tag II的*性能被越来越多的科研者认识并应用。
 
2. 大分子量增溶性融合蛋白:如GST (谷胱甘肽-S 转移酶), MBP(麦芽糖结合蛋白),SUMO(泛素样修饰蛋白),NusA(转录终止抗终止因子),TrxA(大肠杆菌硫氧还蛋白),DsbA(蛋白质二硫键异构酶)等,这类融合蛋白的主要功能是提高靶蛋白的可溶性,促进靶蛋白正确折叠,提高稳定性。其中GST标签蛋白可直接利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione sepharose)亲和树脂进行纯化,MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。其他几个融合蛋白则不能直接纯化,蛋白融合构建时需要和用于纯化的小标签联用,如在靶蛋白N端融合His-SUMO的方式。但是由于这些融合蛋白的分子量比较大,容易影响到靶蛋白的构象和功能,因此纯化后需要切除,通常的方式是在融合蛋白和靶蛋白之间加入蛋白酶(一般有肠激酶,TEV,凝血酶,Xa因子)识别特异序列,切割后经过亲和层析,去除标签蛋白部分,得到靶蛋白,但会在靶蛋白N端残留2-3个氨基酸,一般不会影响靶蛋白的结构和活性,但有些蛋白的活性对N端的外源氨基酸很敏感,甚至多出一个外源氨基酸都会影响到蛋白的活性。
需要重点指出SUMO作为融合蛋白的一个重要优点,即SUMO蛋白酶特异地识别完整的SUMO标签蛋白序列,*移除SUMO标签蛋白,不会残留外源氨基酸。SUMO蛋白酶在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力,例如温度(4~30℃)、pH(5.5~9.5)等。SUMO蛋白酶带有多聚His标签,融合蛋白切割后可进行亲和层析纯化,去除SUMO蛋白酶,得到天然的目的蛋白。针对SUMO的这一优势,目前科研人员对SUMO进行改造,提高其稳定性,开发了一系列SUMO融合表达产品,分别针对原核表达系统,酵母表达系统,昆虫表达系统和哺乳动物表达系统的表达载体和SUMO蛋白酶等,被越来越广泛的应用。
 
3. 报告性融合蛋白:这类融合蛋白常用的有eGFP(增强型绿色荧光蛋白),eCFP(增强型青色荧光蛋白)和eYFP(增强型黄色荧光蛋白)等荧光蛋白,均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变而来,荧光强度更强、荧光性质更稳定。融合这些荧光蛋白,可进行目标基因的活细胞检测,这些荧光蛋白自发荧光,无需使用抗体或原位杂交等技术,无需破碎组织细胞,直接通过荧光显微镜就可在活细胞状态下实时观察目的基因在细胞中的亚细胞定位和表达情况,可谓活细胞探针。如果两个蛋白分别融合不同荧光蛋白,通过FRET原理,还可进行活体细胞中蛋白互作的研究。荧光蛋白作为标签蛋白,还有以下优势:自发荧光,不用破碎组织细胞,观察目的基因的实时定位和表达情况;荧光性质稳定,不受细胞内其他产物的干扰;消耗低,检测快速简便,灵敏度高且重现性好,非常适合高通量的药物筛选。目前这些荧光蛋白已经被广泛应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等。

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