PeproTech 重组人IFN-γ （Animal Free）

生产商          产品名称                                        产品编号         产品规格
PeproTech 重组人Flt-3 Ligand (Animal Free)    AF-300-19 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人IL-7 (Animal Free)      AF-200-07 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人IL-15 (Animal Free)    AF-200-15 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重组人SCF (Animal Free)       AF-300-07 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech
(BioGems)  人CD28 激发型单抗 (极低内毒素)   (克隆：CD28.2)    10311-25 100ug/500ug

生产商         产品名称                     产品编号          产品规格        使用浓度
PeproTech 重组人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100ug/250ug/500ug/1mg 50ng/ml
PeproTech 重组人IL1-α (Animal Free) AF-200-01A 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重组人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50ug/100ug/250ug/500ug/1mg 30ng/ml
PeproTech (BioGems)    人CD3 激发型单抗 (极低内毒素)  (克隆：OKT-3)05121-25 100ug/500ug 50ng/ml

注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白
的混入，使得zui终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染
及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中使用无动物成分的重组细胞
因子。

【参考文献】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:
a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133

CIK 细胞的制备方法:

【背景】
CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells"的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞"。
CIK 是单个核细胞在CD3 单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培养获得的一
群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活
性，又具有NK 细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。
CIK 细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前
临床上广泛使用的过继性免疫-治疗细胞。

【培养原理】
CIK 培养用细胞因子和抗体：
?? CD3 激发型单抗：

T 细胞活化的*信号来自于T 细胞表面的受体，即T 细胞抗原受体(T cell antigen
receptor, TCR)与APC 提呈的抗原的特异性结合，也就是T 细胞对抗原的特异性识别。
TCR 是由2 条不同肽链构成的异二聚体，在T 细胞表面，其与CD3 分子通过非共价键
结合，形成TCR/CD3 复合体。TCR 识别特异性抗原后会引起CD3 和T 细胞表面的辅助
受体CD4 或CD8 分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪-氨酸激酶(Lck, Fyn
和ZAP-70 等)，促使CD3 分子胞浆区的免疫受体酪-氨酸活化基序(immunoreceptor
tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪-氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪-氨酸(pY)进一步
磷酸化下游含酪-氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP 激
酶途径等)，zui终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T 细胞增殖和活
化的靶基因(如IL-2 和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T 细胞因而由静止状态转为
增殖和活化状态。

由上可见，CD3 分子在T 细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3 激发
型单抗与T 细胞表面CD3 分子特异性结合后，可引起CD3 分子胞浆区ITAM 基序中酪
-氨酸的磷酸化，进而导致T 细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T 细胞增殖和活
化。也就是说，CD3 激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3 复合物的识别和激活过程，
从而引起T 细胞的增殖与活化，因此是CIK 细胞培养中*的刺激因素。

此外，CD3 激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3
的CD3 激发型单抗可以刺激所有人的T 细胞的增殖，而其它克隆号的CD3 激发型单抗
仅能刺激一部分人的T 细胞。因此，在进行CIK 培养时，选用OKT-3 克隆，以保
证每个患者的T 细胞均能被激活。

?? IL-2 (白细胞介素-2)
IL-2 zui初发现时被称为T 细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 细胞
增殖zui重要的细胞因子。IL-2 既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T

细胞表面的IL-2 受体(IL-2R)的特异性结合而促使T 细胞活化，并进入细胞分裂状态。
此外，IL-2 还可刺激NK 细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK 细胞培养中须添加
IL-2，以促进T 细胞的增殖与活化。
?? IFN-γ (干扰素-γ)
IFN-γ 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促
增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。
研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- γ，培养24后再
加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。

?? IL-1α(白细胞介素-1α)
IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-γ和激发型
CD3 单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。

【细胞制备】
1． 外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3 无血清培养液洗涤2 次，获得纯度在90%以上的PBMC。

2． CIK 细胞的培养及鉴定
2.1 将PBMC 按1-2 x 106/ml 的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组
人IFN-γ，37oC，5%CO2 培养箱中培养；
2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细
胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml 的重组人IL-1α。
2.3 每3 天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
2.4 在培养的第14d，收获CIK 细胞。
2.5 CIK 细胞质控：
2.9.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
2.9.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表达：CD3+CD56+细
胞的比例应在20%以上。
2.9.3 细胞杀伤实验：以CIK 细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或
肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入
96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104 个，终体积为200 μl，设3 个复孔。
培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶
细胞的杀伤率。
2.9.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，
及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。